Bevezetés

A leggyakoribb non-Hodgkin limfóma, a CD20 pozitív, de morfológiailag heterogén és különböző klinikai lefolyást mutató diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBCL) a klasszikus, Lymphochip-alapú génexpressziós profil (GEP) vizsgálatok szerint legalább kettő, molekulárisan eltérő és prognosztikailag különböző betegségnek felelt meg [1]. A germinalis centrum B-sejt (GCB), valamint az aktivált B-sejt (ABC)-szerű molekuláris szubtípusok létezését egy független, oligonukleotid génchip platform (Affimetrix, Santa Clara, CA) is megerősítette, és kiegészítette egy harmadik, nem osztályozható, a GCB, illetve az ABC típusú GEP mintázattól eltérő expressziós profilt mutató, de rossz prognózisú DLBCL altípussal [2, 3]. A DLBCL sejteredetének (‘cell-of-origin’, COO) megállapítására az immunhisztológiailag (IH) meghatározott proteinexpressziós algoritmusok is bevezetésre kerültek, melyet a GEP-alapú sejteredet-meghatározás széles körű rendelkezésre állásának hiánya miatt a WHO-2016 limfómaklasszifikáció is elfogadott [4]. Ezek közül a legelőször bevezetett és legszélesebb körben alkalmazott, a CD10, BCL6 és a MUM1 proteinek expresszióját immunhisztológiával vizsgáló Hans' algoritmus sem tudja elkülöníteni a GEP-pel nem osztályozható csoportot, és a DLBCL betegséget GCB-szerű és nem GCB/ABC-szerű, az előbbi javára szignifikánsan jobb klinikai lefolyást mutató csoportokba sorolja [5]. A DLBCL betegség citogenetikai heterogenitására vonatkozó növekvő ismeretanyag egy új entitás elfogadásához vezetett a WHO-2016 limfómaklasszifikációban: MYC és BCL2 és/vagy BCL6 átrendeződést (R) mutató magas malignitású B-sejtes limfóma (HGBL), melyet ezen molekuláris sajátságok miatt tripla aberrációt (‘triple hit’, TH) vagy dupla aberrációt (‘double hit’, DH) mutató limfómának neveztek el [6].

A nagy nemzetközi tanulmányokban jelentkező ellentmondások, például az izolált MYC-R, az ebben részt vevő partnergének, a MYC-R melletti más átrendeződések, ezen genetikai aberrációk különböző kombinációinak, továbbá a MYC, BCL2 és BCL6 gének kópiaszám-eltéréseinek (CNA) prognosztikai szerepe nem kerültek minden vonatkozásban feloldásra. Ez magyarázza a jelenleg is intenzív, a prognózis prediktív genetikai aberrációk, mutációk, kópiaszám-eltérések vagy génfúziók feltárására irányuló kutatásokat, melyek célja a DLBCL individualis medicina típusú kezelésének megalapozása [7–20].

Multicentrikus tanulmányunkban egy reprezentatívnak vélt DLBCL betegcsoport sejteredet (COO), IGH::MYC, IGH::BCL2 és BCL6 gén átrendeződés (R), illetve kópiaszám-növekedés (CNA), valamint génexpressziós profil (GEP) szerinti vizsgálatát végeztük el annak érdekében, hogy a DLBCL ezen paraméterei geográfiai jellegzetességeit feltárjuk.

Anyag és módszer

A vizsgálatokat a PTE Klinikai Központ Pathologiai Intézetének konzíliumi anyagán végeztük, melyből 344, legalább 5 éves követéssel rendelkező mintát választottunk ki. Ebből mind a 7 immunhisztológiai, valamint a 4 genetikai lókuszt reprezentáló 3 iFISH-vizsgálat értékelhető eredményt 276 esetben adott. Ez a pathologiai minta (paraffinos blokk) kollekció 12 egészségügyi intézmény pathologiai osztályáról származott, melyek az affiliációban szereplő székhely szerint a következők, zárójelben a részvételi esetszámmal: Békéscsaba (6), Dunaújváros (16), DPC-OHII Budapest (30), Győr (4), Miskolc (55), Nagykanizsa (3), PTE Pécs (30), Siófok (15), Kaposvár (88), Szekszárd (14), SZTE Szeged (8), Veszprém (7). E kohorszban az FFPE blokkokból extrahált RNS és az azt követő transzkriptom új generációs szekvenálás (NGS) alapján 173 mintában volt genomexpressziós profil (GEP) vizsgálat elvégezhető.

Hisztologiai-immunhisztologiai vizsgálatok: A paraffinos blokkokból újra elvégeztük a teljes pathologiai feldolgozást, komplettáltuk az IH-profilozást, diagnóziskorrekció miatt egyetlen esetet sem kellett kizárni. Az IH-vizsgálatokhoz CD10, CD20 (Visionbiosystems Novocastra, UK), MUM1, BCL2, BCL6 (Dako, Dánia), MYC (Abcam, UK), Ki-67 (Hisztopatológia Kft., Magyarország) specifikus primér antitesteket, valamint Envision+ System-HRP (DakoCytomation, Dánia) és Bond Polymer Refine Detection (Leica Biosystems, UK) előhívó reagenseket alkalmaztunk. A Hans' algoritmus szerint legalább 30%-os pozitivitás esetén tekinthető pozitívnak a tumor egy bizonyos markerre. Az algoritmus szerint GCB-szerű csoportbesorolást kap a tumor, ha CD10+ (BCL6+/−, MUM1+/−) vagy CD10−, BCL6+, MUM1- fenotípust mutat. Nem GCB/ABC-szerű a besorolás minden egyéb – CD10−, BCL6+, MUM1+ vagy CD10−, BCL6–, MUM1+ fenotípus esetén [5]. Dupla protein expresszor (DPE) besorolást kapott a tumor kombinált BCL2 (≥50%) és MYC (≥40%) immunhisztológiai pozitivitás esetén [6].

Interfázis fluoreszcens in situ hibridizáció (iFISH): A paraffinos blokkok 5 μm-es metszetein a mintákat iFISH-eljárással – a szonda kit gyártó előírásait követve – teszteltük MYC::IGH, IGH::BCL2, BCL6 átrendeződésre (R), valamint MYC (8q24), BCL2 (18q21) és BCL6 (3q27) nyerésre/amplifikációra (G/A). Ehhez Vysis IGH/MYC/CEP8 TC-DF, Vysis LSI IGH/BCL2 DC-DF és Vysis LSI BCL6 (ABR) DC Break Apart szondakészleteket (Abbott Molecular Inc., USA) használtunk fel. Az iFISH-reakciókat a gyártó előírásai szerint, Zeiss Axioplan-MOT II fluoreszcens mikroszkópban ‘grid sampling’ és ‘color rationing’ módszerekkel értékeltük ki [21]. Átrendeződés (R) pozitívnak tekintettük a tumort IGH/MYC, IGH/BCL2, illetve BCL6 szonda esetén, ha a fúziós, illetve a disszociált iFISH jeleket a sejtmagok legalább 50%-a hordozta. A nyerés/amplifikáció (G/A) definíciója MYC, BCL2 és BCL6 esetében magában foglalta a releváns kromoszóma poliploiditásának hiányát és/vagy a sejtmagok legalább 50%-ban legalább 1 kópia géntöbblet kimutathatóságát, valamint dupla parányok [‘double minutes'] és/vagy gyöngyfüzérszerű [‘beaded lace-like’] jelek és/vagy megszámlálhatatlan (homogén festődésű régió – ‘HSR’ vagy felhőszerű – ‘cloudy-like’) szignálok jelenlétét.

RNS-könyvtár-készítés és szekvenálás: A paraffinos blokkok 10 μm-es metszeteiből RNeasy FFPE isol kit (Qiagen, Németország) alkalmazásával történt az RNS-izolálás, majd NanoDrop ND-1000 (Thermo Fischer Scientific, USA) készülékkel a mennyiség és a tisztasági fok meghatározása. Az RNS-könyvtárak készítését QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit FWD for Illumina (Lexogen, Ausztria) segítségével végeztük. Mintánként 100 ng total RNS reverz transzkripciója valósult meg egyszálú komplementer DNS-re (cDNS) oligodT primerekkel, majd az RNS eltávolításra került. Ezt követően a második cDNS-szálat szintetizáltuk random primerek segítségével, majd a termékeket tisztítottuk mágneses gyöngyökkel. Végül a könyvtárakat amplifikáltuk, és vonalkód-szekvenciával (barcode) láttuk el PCR alkalmazásával. Az elkészült könyvtárakban TapeStation 4200 (Agilent) készülékkel ellenőriztük adapter dimer PCR műtermékek képződését. A QuantSeq könyvtárakat Illumina NextSeq550 készülékkel szekvenáltuk 75 bp single-end leolvasási módban.

Bioinformatika – statisztika: A leolvasott szekvenciákat a Homo sapiens referencia genomra illesztettük (GRCh37 Ensembl) a STAR v2.5.3a programmal [22]. Ezután a fehérjekódoló génekre illesztett readek számát meghatároztuk a HTSeq programcsomaggal (v0.11.1) [22]. A gén count adatokat normalizáltuk az M-értékek trimmelt átlaga (TMM) módszerrel az edgeR R/Bioconductor programcsomagokkal (v3.28, R v3.6.0, Bioconductor v3.9) [23]. A statisztikai próbákhoz az adatokat logtranszformáltuk a voom megközelítéssel a limma programcsomaggal [24, 25]. A normalizált gén count adatokat transzkriptum per millió (TPM) formában reprezentáltuk. A limma csomag segítségével összehasonlítottuk a csoportokat lineáris modell alkalmazásával, amellyel fold change és módosított p-értékeket, majd Benjamini–Hochberg-módszerrel a False Discovery Rate (FDR) megközelítéssel illesztett p-értékeket számoltunk. A differenciáltan kifejezett gének TPM-értékeit hierarchikus klaszterelemzéssel, Pearson-korreláció és átlagos kapcsoltság (average linkage) módszerrel vizsgáltuk és hőtérképpel vizualizáltuk a pheatmap R csomaggal (v1.0.12). A Wan-Hui és mtsai (2020) által meghatározott, a DLBCL-sejteredet (cell-of-origin, COO) csoportosítással szignifikánsan összefüggő 32 gén közül a mintáinkban kimutatott transzkripttel rendelkező 28 gén TPM-értékei alapján hierarchikus klaszterelemzést és hőtérképen történő vizualizációt alkalmaztunk a fenti módon [26].

Chi-négyzet-tesztet alkalmaztunk a különböző feno- és genotípus sejtparaméterek megoszlásának vizsgálatára. Ehhez az R stats csomagból a chiq.test függvényt (R Core Team, 2021) használtuk fel. A pozitív és negatív prediktív értéket (PPÉ, NPÉ) a különböző geno- és fenotípuscsoportok vs. DPE státusz kontingenciatáblázataiból nyert valódi pozitív (VP), álpozitív (ÁP), valódi negatív (VN), álnegatív (ÁN) értékek alapján, a VP/VP+ÁP és VN/VN+ÁN képletek alapján számoltuk.

Eredmények

A teljes immunhisztológiai és iFISH-panellel értékelhető eredményt adó, összesen 276 DLBCL-tumormintát vizsgálhattunk. A sejteredet (COO) vonatkozásában, a Hans' immunhisztológiai algoritmus alapján, a 276 tumorból 103 (37,3%) GCB-sejt-szerű, míg 173 (62,7%) nem GCB-sejt-szerű DLBCL altípusba sorolódott. A GEP-vizsgálat során azonosított differenciáltan expresszált gének a GCB vs. nem GCB Hans' DLBCL-csoportokat magas hatékonysággal különítették el. A Hans algoritmus, valamint a GEP-vizsgálat alapján azonos csoport besorolást nyert az összes eset 82,6%-a (1. ábra). Az ábra jobb felső zónájában, a döntően Hans' nem GCB fenotípusú esetek között alcsoportosodást, azaz GEP-heterogenitást mutat a hőtérkép. A GEP-vizsgálat ugyanakkor, szignifikáns heterogenitást tárt fel az egyaránt Hans' GCB besorolásba tartozó, 6/103 (5,8%) illetve a 22/103 (213%) gyakoriságot képviselő CD10+/MUM1+ vs BCL6+ csoportok között (2. ábra).

View Full Size

Az expressziós profil alapján létrehozott hőtérképen meghatározott 2 csoport 82,6% átfedést mutatott a Hans' algoritmus szerint definiált GCB, valamint nem GCB besorolással

Citation: Hematológia–Transzfuziológia 55, 4; 10.1556/2068.2023.00157

• Download Figure
• Download figure as PowerPoint slide

View Full Size

Az egyaránt a Hans' GCB csoportba tartozó CD10+, MUM1+, valamint BCL6+ fenotípusú csoport szignifikáns GEP-heterogenitást mutatott

Citation: Hematológia–Transzfuziológia 55, 4; 10.1556/2068.2023.00157

• Download Figure
• Download figure as PowerPoint slide

Az IGH::MYC, IGH::BCL2 fúzió illetve BCL6 törés típusú átrendeződések (R) incidenciája a teljes vizsgált DLBCL-kohorszban 16/276 (5,8%), 20/276 (7,2%), illetve 46/276 (16,7%) értékeknek felelt meg (1. táblázat). A MYC gén amplifikációja 7/276 (2,5%) gyakorisággal fordult elő, melyet az átlagos 2,55x allélarány (kb. 3 géndózistöbblet) jellemzett. A BCL2 amplifikáció ugyanezen adatai: 37/276 (13,4%), átlagosan 1,95 allélarány (kb. 2 gén dózis többlet). A BCL6 amplifikációja csak 0,7%-ban (2/276) volt észlelhető, 4,05–4,22 fúziós jel/mag arány (kb. 2x gén dózis többlet) és gyöngyfüzérszerű amplifikáció mellett. Az amplifikáció értékelésénél nem vettük figyelembe a megszámlálhatatlan, homogén festődési régió (‘HSR’), valamint felhőszerű (‘cloudy like’) iFISH-jeleket tartalmazó magokat. A MYC és a BCL2 gén vonatkozásában egyaránt 2–2/276 (0,7–0,7%) gyakorisággal fordultak elő ilyen iFISH-jelenségek a DLBCL-kohorszban (3. ábra).

View Full Size

Típusos iFISH jel mintázatok génátrendeződés, valamint géntöbblet (nyerés/amplifikáció) esetén. a MYC piros (P) jel, IGH zöld (Z) jel, IGH::MYC átrendeződés – kolokalizált/sárga fúziós (F) jel; b BCL6 telomerikus 3q27 régió P jel, centromerikus 3q27 régió Z jel, intakt BCL6 gén – kolokalizált szignálok, BCL6 gén törés – önálló Z/P jelek; c MYC (P), IGH (Z), CEP8-Aqua (A), ∼9-szeres P/Z, illetve P/A arány (kb. 16 MYC géntöbblet), < homogénen festődő régió – HSR, << felhőszerű iFISH jelölődés; d BCL2 P jel, IGH Z jel, ∼3,5-szörös P/Z amplifikáció (∼5 BCL2 géntöbblet), e ∼ 4-szeres P-Z kolokalizált jel/mag (∼6-szoros BCL6 géntöbblet), telomerikus 3q27 régió Z jel, centromerikus 3q27 régió P jel; d és e gyöngyfűzérszerű iFISH jel mintázat – intrakromoszómális gén sokszorozódás; a – e 63x olaj immerzió

Citation: Hematológia–Transzfuziológia 55, 4; 10.1556/2068.2023.00157

• Download Figure
• Download figure as PowerPoint slide

Az izolált IGH:MYC aberráció 6/103 (5,8%), illetve 6/173 (3,5%) arányban fordult elő a GCB, valamint a nem GCB csoportban, és nem mutatott szignifikánsan eltérő halmozódást a Hans' főcsoportokban. Tripla aberrációt (TH) vagy IGH::MYC/BCL6 átrendeződés típusú dupla aberrációt (DH-2) hordozó limfóma egyik Hans' csoportban sem fordult elő. Az izolált BCL6-R típusú aberráció a nem GCB csoportban volt gyakoribb (33/173, 19,0%), és ezzel a fenotípussal szignifikáns összefüggést mutatott (P = 0,013). Az IGH::BCL2 átrendeződés izoláltan és más aberrációval kombinációban 20/103 (19,4%) illetve 0/173 (0%) gyakorisággal fordult elő a GCB, valamint a nem GCB csoportban. Így szignifikáns halmozódást mutatott izoláltan (P = 0), kombinációban IGH::MYC átrendeződéssel (DH-1; P = 0,018), BCL6 töréssel (P = 0,008) vagy minden IGH::BCL2 átrendeződést mutató DLBCL-re nézve (P = 0,001), a GCB fenotípusú limfómákban, miközben ez a genetikai konstelláció egyáltalán nem fordult elő a nem GCB fenotípusú tumorokban. Ugyanakkor a BCL2 gént érintő aberrációk mindegyike nyerés/amplifikáció (G/A) típusú volt a nem GCB-sejt-szerű daganatokban. Ennek ellenére a MYC, BCL2, illetve BCL6 gének kópiaszám eltéréseinek gyakorisága nem mutatott szignifikáns asszociációt egyik Hans' csoporttal sem (4. ábra).

View Full Size

Az Y tengely az esetek fenotípus (GCB – zöld, illetve nem GCB – sárga) megoszlását mutatja, mely stratifikáltan kerül bemutatásra, aszerint, hogy a fenotípuscsoportban az X tengelyen jelzett aberráció átrendeződés (GCB^R – sötétzöld; nem GCB^R – sötétsárga) vagy gén nyerés/amplifikáció (GCB^G/A – világoszöld; nem GCB^G/A – világossárga) típusú volt. A dupla protein expresszor (DPE) esetek száma az egyes oszlopok feletti esetszámok mellett zárójelben jelenik meg. MYC = 8q24, BCL2 = 18q21, BCL6 = 3q27. Az IGH::MYC, IGH::BCL2, BCL6 génátrendeződések (R,), valamint a MYC, BCL2, BCL6 gén nyerésének (G/A,) gyakorisága izoláltan vagy kombinációkban a Hans' GCB (), valamint nem GCB () fenotípuscsoportokban. Ha a kombinált aberrációk esetén nem mindegyik aberráció átrendeződés tipusú volt, a tumor a kombinált gén nyerés típusú alcsoportba sorolódott

Citation: Hematológia–Transzfuziológia 55, 4; 10.1556/2068.2023.00157

• Download Figure
• Download figure as PowerPoint slide

A DPE+ státusz előfordulása magas volt a GCB (83,4%) és a nem GCB (88,4%) csoportban egyaránt és gyakorisága nem mutatott szignifikáns eltérést a két Hans' csoportban.

A DPE+ fenotípus szignifikáns asszociációt nem mutatott a nem GCB csoportban a csak izoláltan előforduló MYC-R+ és a BCL6-R+ alcsoportokkal, ugyanez vonatkozik a GCB csoportban a MYC-R típusú aberrációt, illetve a BCL2 átrendeződést izoláltan vagy kombinációban hordozó alcsoportokra is. A DPE+ fenotípus csak a GCB csoportban és csak a MYC vagy BCL2 átrendeződést izoláltan vagy bármilyen kombinációban hordozó molekuláris alcsoportra bizonyult szignifikánsan gyakoribbnak (P = 0,02). A DPE fenotípus pozitív prediktív értéke (PPV) a nem GCB csoport fenti 2 molekuláris alcsoportjára: 0,04–0,19. Ugyanezen érték a GCB csoport 3 molekuláris alcsoportjára a 0,12–0,30 tartományba esett (2. táblázat). A DPE fenotípus negatív prediktív értéke (NPV) a két Hans csoport összesen öt molekuláris alcsoportjából 4-ben 1,00-nek bizonyult, egyedül a nem GCB – BCL6-R+ alcsoportban volt alacsonyabb, 0,85.

Megbeszélés

A leggyakoribb limfóma, a CD20+ nagy B-sejtes limfóma, a non-Hodgkin limfómák 30–40%-át teszi ki a különböző földrajzi térségekben. Ennek 80–85%-a diffúz növekedési mintázatot mutat, ezért diffúz nagy B-sejtes limfómának (DLBCL-nek) nevezik. További és ritkább, összességében 15–20%-ot kitevő, nagy B-sejtekből felépülő limfómák is léteznek, melyeket egyedi klinikopathologiai sajátosságaik miatt a vizsgálatunk alatt érvényes (WHO-HAEM4R) valamint a jelenlegi (WHO-HAEM5) osztályozás is más elnevezések alatt határoz meg [6, 20, 27]. Jelen tanulmányunk tárgyát az előbbi, DLBCL csoportba tartozó betegségek képezték. A Burkitt-limfóma eseteket a WHO-meghatározás alapján kizártuk. A ritka és meglehetősen szubjektív morfológiai jegyek alapján véleményezett, ún. diffúz magas malignitású B-sejtes limfóma (HGBL) esetek a tanulmány részét képezték. A DLBCL morfológiai, fenotípusos, molekuláris genetikai és geográfiai heterogenitása állhat annak hátterében, hogy a betegség 5 éves általános túlélése a mai kezelések mellett 60–70% [12].

Emiatt a DLBCL patobiológiája intenzív kutatások tárgya, melyek célja a precíziós medicina típusú kezelhetőség megalapozása. Hazánkban a DLBCL átfogó, fenotipikus, citogenetikai és génexpressziós profil (GEP) alapú együttes vizsgálata nem került még bemutatásra/publikálásra, ezért egy multicentrikus tanulmányban 276 DLBCL betegség ilyen irányú, komplex jellemzését végeztük el és adjuk közre a vizsgálatok eredményét.

A CD10, BCL6, MUM1 immunhisztokémiai reaktivitás és a Hans' algoritmus alapján a limfómák közel 1/3-a (37,3%-a) nyert GCB-sejt-szerű, míg közel 2/3-a (62,7%) nem GCB-sejt-szerű besorolást. Ez a Hans' osztályozás alapján publikált adatokban észlelt GCB típusú limfómák gyakorisági tartományának alsó határa körüli GCB típusú DLBCL arányt és jelentős nem GCB-sejt-szerű limfóma túlsúlyt mutat az általunk vizsgált beteganyagban [7, 15, 28]. A Hans' fenotípus stratifikáció ebben a tanulmányban megbízhatónak tartható, mivel a GEP vizsgálat során azonosított, differenciáltan expresszált gének, valamint a Hans' klasszifikáció alapján a DLBCL esetek 82,6%-ban azonos besorolást nyertek. Továbbá a vizsgált kohorsz Hans' osztályozása és a közelmúltban publikált, 32 génes klasszifikáló alapján végzett GEP csoport analízisünk jó korrelációt, 81,0%-ban megegyező besorolást mutatott [26]. A fenti Hans' és GEP klasszifikáció közötti eltéréseket magyarázhatja az az ismert tény, hogy a DLBCL esetek 15–20%-ot kitevő, GEP alapján nem osztályozható csoportját immunhisztológiai profil alapján sem lehet felismerni [6]. Ezt példázza az az eredményünk is, miszerint a GEP-analízis heterogenitást is mutatott mind a Hans' GCB, mind a nem GCB csoportban egyaránt. A klinikai adatok birtokában tervezzük annak vizsgálatát, hogy a homogén fenotípuscsoportokban észlelt GEP-heterogenitás képvisel-e prognosztikai heterogenitást.

DLBCL-ben az IGH::MYC, IGH::BCL2 fúzió, illetve a BCL6 törés típusú átrendeződések (R) incidenciája – a nemzetközi adatok alapján – tág határok között, a 4–24%, 3–30%, illetve a 14–30% tartományban mozog [8, 9, 12–15, 28–31]. Ezen aberrációk incidenciái jelen kohorszban ezen tartományok alsó zónájába esnek. Feltűnő, hogy a nemzetközi adatok alapján a 0,5–10%, 0,5–1,5%, illetve 0–3% incidenciatartományt mutató DH-1, DH-2, illetve TH limfóma közül e vizsgálatban csak a DH-1, MYC-R és BCL2-R genotípusú limfóma mutatható ki 1,4% arányban, míg a másik kettő nem fordul elő. Ezt geográfiai különbségeken kívül nehéz lenne mással magyarázni. Nem valószínűsíthető, hogy az eredményeket befolyásolta az, hogy a MYC-R aberrációt az IGH::MYC specifikus dupla fúziós (DF) iFISH-szondával vizsgáltuk, mivel az összes MYC átrendeződésnek csak kb. 10%-ában szerepelnek partnerként az immunglobulin könnyűláncok (MYC/IGL), a DF iFISH-szonda szenzitivitása az ‘elváló’ (BA) szondánál 5–10%-kal magasabb, továbbá a 40–50%-ot kitevő, nem IG génnel történő átrendeződés (MYC-R-nemIG) vizsgálata – ismeretlen hatása miatt – jelenleg nem elvárt [8, 9, 12, 16].

Az izolált MYC-R nem szignifikáns megoszlása a GCB vs. nem GCB főcsoportok között arra utalhat, hogy ez az aberráció önmagában nem tehető felelőssé a két főcsoport közötti, irodalmilag dokumentált, prognosztikai különbségekért [10, 12]. Az izolált vagy kombinált BCL2-R GCB limfómákhoz, a BCL6-R nem GCB limfómákhoz mutatott szignifikáns asszociációja ezen aberrációk független, prognózist befolyásoló szerepére utalhatnak. Az a tény, hogy a MYC, BCL2 és BCL6 gének kópiaszámeltéréseinek egyikénél sem lehetett szignifikáns halmozódást kimutatni a Hans' főcsoportok között, ezen genetikai eltérések prognózist nem befolyásoló hatását vélelmezhetik. E témakörben a kópiaszámeltérések prognosztikai hatására vonatkozó, ellentmondásos publikációk sora ismert, beleértve a nagyon ritka magas grádusú amplifikáció (‘megszámlálhatatlan iFISH szignál’ típusú aberráció) jelentőségét, egyáltalán a kópiaszám-küszöbérték meghatározásának hiányát [12, 18, 28].

A DLBCL-ben prognosztikus genetikai eltérések, transzlokációk, amplifikációk, vizsgálata iFISH-eljárással történik. Ez azonban drága, időt, szakértő humán erőforrást és laboratóriumi technikát igénylő eljárás. Ezért felmerül, hogy előzetes szűréssel lehet-e csökkenteni az iFISH-sel vizsgálandó DLBCL szövetminták arányát, a pozítiv minták vesztése nélkül. Jelen tanulmányban a prognosztikus dupla protein expresszor (DPE, MYC és BCL2) klasszifikáló erejét vizsgáltuk. A DPE+ fenotípus azonban a sejteredet szerinti Hans' főcsoportokkal, ezek molekuláris alcsoportjai között – döntő többségben – nem mutatott szignifikáns összefüggést. Alacsony szenzitivitása és specificitása miatt a pozitív prediktív értéke (PPV) olyan alacsony – kevesebb mint 0,30 – zónába esik, mely hatékony, legalább 95%-os konfidenciájú előszűrő alkalmazását nem teszi lehetővé. A DPE negatív prediktív értéke (NPV) viszont a két Hans' főcsoport összesen 6 molekuláris alcsoportjából 5-ben, belefoglalva a legfontosabb MYC-R, BCL2-R aberrációkat és kombinációikat, 1,00, azaz a DPE negatív fenotípus 100%-os megbízhatósággal előszűri a prognosztikus genetikai aberrációra negatív, iFISH-eljárással nem vizsgálandó, DLBCL mintákat. Ez az eredményünk nagyfokban megegyezik három másik tanulmányban a DPE-, illetve a MYC protein- fenotípus negatív prediktív értékére vonatkozó észleletekkel, annak ellenére, hogy az ezekben észlelt 34–41%-os DPE-pozitivitásnál tanulmányunkban jelentősen magasabb ezen fenotípus gyakorisága [13–15].

Vizsgálataink alapján nyert főbb következtetéseink:

1. Az izolált IGH::MYC a DLBCL Hans' főcsoportokra nem specifikus genotípus.

2. Az IGH::BCL2, izoláltan vagy kombinációban, GCB-szerű limfóma asszociált esemény.

3. A BCL6-R a nem GCB-szerű Hans' limfóma csoport molekuláris fémjele.

4. A MYC, BCL2, BCL6 kópiaszám eltérések (nyerés, illetve amplifikáció) mindkét Hans' DLBCL csoportban előfordulnak.

5. A DPE-fenotípus 100%-os konfidenciával kizárja az IGH::MYC, valamint az IGH::BCL2 és ezek kombinációit hordozó DLBCL genotípusokat.

Nyilatkozat

A közlemény más folyóiratban korábban nem jelent meg, és máshová nem került beküldésre. A levelező szerző elolvasta a szerzői útmutatót.

Anyagi támogatás/köszönetnyilvánítás

A kutatást az NVKP_16-1-2016-0005, az NRDI Hivatal, Magyarország TKP alap, az EFOP-3.6.1-16-2016-0004, TKP 2020/2020-4.1.1., GINOP-2.3.4-15-2020-00010, GINOP-2.3.1-20-2020-00001, BECOMING 2019-1-HU01-KA203-061251, a KA-2019-32, az ELIXIR Magyarország és az MTA PAB Klinikopathologiai Munkabizottsága támogatta.

Etikai Bizottsági engedély – Helsinki Deklaráció

PTE KK RIKEB, ETT TUKEB szakhatósági hozzájárulás alapján kiadott EGYÉI 50268-8/2017 sz. engedély. A dolgozat nem sérti a Helsinki Deklaráció (1975, revízió 2008) előírásait.

Szerzői munkamegosztás

VNI, PL, AH, GyA tervezte a projektet, KJ, HR, GB végezte a GEP és a bioinformatikai vizsgálatokat, RZs, BaA, AH analizálta a klinikai adatokat, HG, BT, CzJ, PA, ÖG, BE, LE, KN, BO, BoA, TL végezte a primer pathologiai diagnosztikát, PL, KL végezte a pathologiai konziliumi diagnosztikát, PL, PG értékelte az iFISH-vizsgálatokat, PL, GyA írta a kéziratot, KB, TT publikációs konzulensként működött közre. Valamennyi szerző olvasta és jóváhagyta a kéziratot.

Érdekeltségek

A szerzőknek nincsenek érdekeltségeik.